伊豆赤沢海洋深層水から分離された微生物が生産するアラビノキシラン分解酵素に関する研究

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1. 伊豆赤沢海洋深層水から分離された微生物が 生産するアラビノキシラン分解酵素に関する研究 Studies on the arabinoxylanase produced by microorganisms from Izu-Akazawa deep-seawater 海洋生命科学専攻 応用微生物学研究室 1351004 安次嶺 一功
2. 発表の流れ  第一章 背景説明  第二章 目的酵素生産候補株スクリーニング方法  第三章 16S rRNA遺伝子解析による菌種同定  第四章 標準菌株との生理・生化学的性状の比較  第五章 酵素活性増加の為の培養条件検討  第六章 分子量分画と酵素活性の至適条件検討  第七章 総括 2
3. 200 m以深に分布する海水 ・低温性 ・富栄養性 ・清浄性 ・恒常性 表層水と異なる特徴を有する 3 (株)DHC DSW給水施設 洋上 5 km 水深 800 m 取水量 5,000 t/月 海洋深層水(DSW)とバッグフィルター(BF) DSWBF 出典:https://www.google.co.jp/maps/
4. アラビノキシラン(AX)と アラビノキシラン分解酵素(AXase) 4 AX: β1-4結合のD-キシロース主鎖にα1-3結合のL-アラビノース側鎖を持つ多糖 Arabinofuranosidase Xylanase Xylanase Arabinofuranosidase
5. L-アラビノースの機能 5 ◦甘味度 スクロースの50％の甘味 ◦代謝 人体への吸収はほとんど無い ◦スクラーゼ阻害 スクラーゼを不拮抗的に阻害 糖吸収と血糖値上昇を抑制 ◦カルシウム吸収促進 小腸でのカルシウム吸収を促進 工業的に生産されており、高コスト (D-グルコース ¥48/g L-アラビノース ¥297/g D-グルコースの約6倍の値段) 微生物種 分離源 発見年 Aspergillus niger 陸土壌 1963 Bacillus subtilis 陸土壌 1971 Aspergillus terreus 砂漠土壌 1996 Clostridium thermocellum 熱水泉 2011
6. DSWBF由来 分離微生物グリセロールストック 薄層クロマトによる一次スクリーニング 酵素活性測定による二次スクリーニング 6 候補株スクリーニングの流れ 分離時と同条件で増殖確認 AX粗分画液を唯一炭素源とする培地で増殖確認 1,019株 892株 502株 6株 2株 (No.92、No.138株)
7. No.92 Bacillus pumilus strain ATCC 7061 (98.4%) Bacillus safensis strain FO-036 (98.4%) Bacillus subtilis Bacillus licheniformis Bacillus indicus strain Sd/3T Bacillus simplex Bacillus megaterium strain: IAM 13418 Bacillus cohnii (DSM 6307 T) Bacillus halmapalus DSM 8723 Bacillus benzoevorans strain DSM5391 7 No.92株の 16S rRNA遺伝子解析による系統樹 リード数 1,219 bp. ()内は相同性
8. No.92株及び標準菌株との 生理・生化学的性状の比較 8 項目 No.92株 NBRC 100820T株 コロニー形状 不定形 円形 増殖可能NaCl濃度(%,w/v) 0-6 0-8 加水分解: ホスファターゼ +* － スキムミルク + － ツイーン80 + － 炭素源利用性: メチル α-D-グルコピラノシド － + D-ツラノース － + myo-イノシトール － + D-アラビノース + － *＋,陽性;－,陰性
9. No.138 Bacillus altitudinis strain 41KF2bT (99.3%) Bacillus pumilus Bacillus aerophilus strain 28KT Bacillus stratosphericus strain 41KF2aT Bacillus pumilus strain ATCC 7061 Bacillus subtilis Bacillus amyloliquefaciens Bacillus aerius strain 24KT Bacillus sonorensis strain NRRL B-23154 Bacillus aquimaris strain GSP18 Bacillus marisflavi strain TF-11 9 No.138株の 16S rRNA遺伝子解析による系統樹 リード数 1,511 bp. ()内は相同性
10. No.138株及び標準菌株との 生理・生化学的性状比較 10 項目 No.138株 JCM 13350T株 増殖可能温度(℃) 5-50 5-30 加水分解: スターチ －* + ホスファターゼ + － スキムミルク + － ツイーン80 － + 炭素源利用性: マルトース + － メチル α-D-グルコピラノシド － + D-ズルシトール － + D-ソルビトール + － *＋,陽性;－,陰性
11. 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 0.00E+00 1.00E+05 2.00E+05 3.00E+05 4.00E+05 5.00E+05 6.00E+05 5 15 20 27 30 37 ▪比活性 (U/mg) ▪増殖量 (cells/ml) 温度 (℃) No.92株の酵素活性及び増殖量に与える 培養温度の影響 11
12. 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 0.00E+00 1.00E+05 2.00E+05 3.00E+05 4.00E+05 5.00E+05 6.00E+05 7.00E+05 5 15 20 27 30 37 ▪比活性 (U/mg) ▪増殖量 (cells/ml) 温度 (℃) No.138株の酵素活性及び増殖量に与える 培養温度の影響 12
13. 酵素活性に与える最適培養条件 13 項目 No.92株 No.138株 温度 (℃) 20-27 20-27 pH 6.5-7.5 7.5 人工海水濃度 (%) 0 0 炭素源 無添加 無添加 窒素源 (NH4 )2 SO4 バクトペプトン
14. 培養液中のAXaseの分子量分画 （50及び10 kDaフィルター） 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 10＞ 50＞, ≧10 ≧50 比活性 (U/mg) 分子量 (kDa) No.92株 No.138株 14 候補株のAXaseは50 kDa以上の画分に存在
15. 0 20 40 60 80 100 120 10 20 30 40 50 60 相対酵素活性 (%) 温度 (℃) No.92株 No.138株 0 20 40 60 80 100 120 1 2 3 4 5 6 7 8 相対酵素活性 (%) pH No.92株 No.138株 50 kDa分子量粗分画AXaseの至適条件 15 ▪No.92株 ▪No.138株
16. 総括  スクリーニングの結果、特に酵素活性の高い2株を候 補株とした。遺伝子の解析により、どちらもBacillus属 と同定した。  生理・生化学的性状を確認した結果、どちらの候補株 も標準菌株と様々な相違点が見られた。  分子量分画の結果、候補株のAXaseも50 kDa以上の 分子量であることが確認された。  粗画分したAXaseの至適条件を調べた結果、No.92 株は40℃、pH 8であり、No.138株は30℃、pH 8であ った。 16
17. 謝辞 17 東京海洋大学 今田 千秋 教授 同 小林 武志 准教授 同 寺原 猛 博士 （株）DHC海洋深層水研究所 山田 勝久 博士 同 野村 道康 氏 同 鈴木 正宏 氏 有限会社イントロン 古門 幸三 氏 本学共同研究員 鈴木 誠治 氏 応用微生物学研究室 学生諸氏