深海微生物の結晶セルロース分解酵素に関する研究

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1. 深海微生物の結晶セルロース分解酵素に関する研究 096401J 安次嶺 一功 http://w3.u-ryukyu.ac.jp/coe/action/img/toku01.jpg ROV Hyper Dolphin 遠隔操作無人探査機 潜行深度 4,500 m
2. 結晶性セルロース分解菌GE35株の分離 分離場所 ： 鹿児島県野間岬沖のマッコウクジラ鯨骨サイト (深度 223–227 m) より分離 分離法 ： ROV hyper dolphin の外にセルロースプレート入りメッシュバッグを 固定し、2時間深海水に浸してサンプリング 深海微生物であるGE35株を様々な培地で培養し、結晶性セルロース 分解酵素系の生産に最適な生育条件を検討する。 研究目的
3. 結晶性セルロース平板の調製法 ① 水飽和のチオシアン酸カルシウム Ca(SCN)2 に1.5%になるように 結晶性セルロースを加え、少なくとも１時間以上撹拌放置する。 ② オートクレーブに入れて120℃で１分間透明になるまで加熱する。 ③ 透明になった溶液をガラスシャーレに入れ、室温放置して固化 させる。 ④ 固化した平板に、メタノールと水を加えて何回も洗浄してCa(SCN)2 を除去する（電気伝導度が10 S/cm以下になるまで洗浄）。 ⑤ 風乾後、シェーカーで振とうしながら滅菌した2倍濃度の生育培養 液を浸みこませる（一昼夜）。 ⑥ 余分な培養液を除去して風乾させる。 ナノファイバーセルロース平板 分子量； 42000 重合度 (DP)； 260 結晶化度； 44.5% 結晶型； セルロース-II （X線分析）
4. ナノファイバーセルロース平板の 分離微生物 （走査型顕微鏡写真） セルロース平板に形成された GE 35株の集落
5. 生育度とCMCase活性に及ぼす窒素源の影響 MB で30 ℃, 2日振盪培養 CMCase活性はジニトロサリチル酸法によって測定 (30℃, pH 7.5) 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 CFE. Specific act. (µmol/mg/h) OD600 Culture Growth Specific activity
6. 生育度とCMCase活性に及ぼすCMCの影響 50 ml MB + 0.5% polypepton-S (control)で30 ℃,1日振盪培養 0 2 4 6 8 10 12 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0 0.1 0.2 0.5 1 CFE. Specific act. (µmol/mg/h) OD600 CMC conc (%) Growth Speific activity
7. GE35株とGilvimarinus agarilyticus • G. agarilyticusは砂浜から分離された細菌であり、今ま での研究結果からアガロースを分解することが分かっ ており、そのため種名がagarilyticusとなっている。 • GE35株は深海水中から分離されているが、 16S rRNA解析等の結果から、G. agarilyticusと近種で あると示唆されている。 • 本研究では、培養試験を通してGE35株と、 G. agarilyticusとの性質の違いを調べた。
8. 生育時間 生育状態 ヨウ素液染色 1 日目 3 日目 GE35株 E. coli E. coli GE35株 アガラーゼ試験 プレート上のコロニーとヨウ素呈色反応 MB + 0.5% polypepton-Sで30 ℃,1-3日静置培養
9. GE35株の糖の資化性とpH低下 Growth Lowering of pH Control + CMC + D-Galactose + D-Glucose + + GlcNAc + Maltose + ± D-Mannnose + L-Arabinose + + D-Xylose + + MBで30 ℃、1日振盪培養
10. Taxonomic characteristic GE35株 G. agarilyticus NaCl (%) for growth 2-15 1-12 Acid production from D-galactose - + D-glucose + + D-xylose + + L-arabinose + + Agarase production - + Growth in PYB w + Growth on D-glucose w + L-arabinose + + D-mannose + + N-acetyl-D-glucosamine + + maltose + + D-xylose w + w: weak GE35株とGilvimarinus agarilyticusとの比較
11. MB: Marine broth 2216 (Difco) Nutrient broth (NB): 0.5 % Bacto peptone, 0.3 % beef Extract, 0.5 % NaCl Peptone-yeast extract broth (PYB): 0.3 % Polypepton-S (Nihon Seiyaku), 0.1 % Bacto yeast extract (Difco), 2.5 % NaCl, 0.1 % MgCl2 .6H2 O GE35株の生育度経時的変化 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Growth (OD600 ) Time (day) MB NB PYB
12. Subtractive Run 1 Run 2 pH OD600 pH OD600 Control (MB) 6.4 1.95 6.1 2.29 Peptone 6.6 0.92 6.8 0.82 Yeast extract 6.7 1.48 6.5 6.35 Ferric citrate 6.4 2.07 6.8 0.97 Sodium chloride 7.2 0.49 6.3 2.04 Magnesium chloride 6.6 1.93 5.9 2.22 Potassium chloride 5.6 2.86 5.8 2.57 Magnesium sulfate 6.7 0.33 7.0 0.17 Calcium chloride 6.9 1.81 7.9 1.43 Sodium bicarbonate 5.7 2.45 5.4 1.97 Potassium bromide 6.2 2.09 6.4 1.82 Strontium chloride 6.3 1.91 5.8 2.16 Boric acid 6.5 1.84 6.5 2 Sodium silicate 6.4 2.04 6.3 2 Sodium fluoride 6.4 1.97 6.4 2.03 Ammonium nitrate 6.5 1.82 6.5 1.77 Disodium phosphate 6.6 1.93 6.1 1.91 GE35株のMB生育におけるオミッションテスト MB + 1 % mannoseで30 ℃、1日振盪培養
13. 結果の要約 • GE35株は、polypepton-S, tryptoneやcasamino acidを窒素源として添加す ると生育度とCMCase活性が増加する。 • GE35株の CMCase は誘導酵素である。 • GE35株は、L-arabinose, D-mannose, N-acetyl-D-glucosamine, maltoseなど の糖を資化でき、 D-glucose, L-arabinose及びD-xyloseから酸を生成する。 • 16S rRNA などの解析から、本株はG. agarilyticusに極めて近種の深海微 生物であることが示唆されるが、糖からの酸生産や塩濃度の生育に及ぼ す影響の違いがあり、かつGE35株はアガラーゼを生産しない。 • GE35株はMBで生育し、PYBとNBでの生育は微弱である。 • GE35株は、アミノ酸態窒素、Naイオン、Feイオン及び無機硫酸に よって生育促進される。