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oku-slide-20230213

Makito Oku
February 13, 2023

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自然発症メタボリックシンドロームマウスの各臓器の遺伝子発現情報に関する解析結果の報告
奥 牧人 (富山大学 齋藤グループ)
2023/02/13
合原ムーンショットプロジェクト 第19回進捗報告会

Makito Oku

February 13, 2023
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Transcript

  1. ムーンショット研究の階層構造 階層 代表者 題目 目標 (プログラム) 祖父江先生 2050年までに、超早期に疾患の 予測・予防をすることができる 社会を実現

    プロジェクト 合原先生 複雑臓器制御系の数理的包括 理解と超早期精密医療への挑戦 課題 齋藤先生 複雑臓器制御系の未病科学的 研究 4 / 162
  2. MS研究で扱うメタボ関連のデータ 今回は一番目のTSODマウスの話をします。 生物 系統 臓器 測定法 分画の有無 マウス TSOD 13臓器

    RNA-seq - マウス C57BL/6 13臓器 RNA-seq - マウス C57BL/6 内臓脂肪 snRNA-seq 非分画 マウス C57BL/6 内臓脂肪 snRNA-seq, scRNA-seq 2分画 ヒト - 内臓脂肪 snRNA-seq 非分画 6 / 162
  3. 先行研究との比較 先行研究 (Koizumi+, Scientific Reports, 2019) との比較 先行研究 本研究 動物モデル

    TSODマウス TSODマウス 臓器 eWATのみ 13臓器 計測法 DNAマイクロアレイ 次世代シーケンサー (RNA-seq) 時点 3, 4, 5, 6, 7 週齢 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10週齢 eWAT: 精巣上体白色脂肪組織、ヒトの内臓脂肪に相当 8 / 162
  4. 13臓器 表記 説明 表記 説明 bat 肩甲骨間の褐色脂肪組織 kidney 腎臓 brain

    大脳 liver 肝臓 ewat 精巣上体白色脂肪組織 lung 肺 gut 腸 muscle 後肢筋肉 heart 心臓 panc 膵臓 hypo 視床下部と脳下垂体の混合物 spleen 脾臓 iwat 鼠径部白色脂肪組織 eWAT: ヒトの内臓脂肪に相当、iWAT: ヒトの皮下脂肪に相当 9 / 162
  5. 基本情報 TSODマウス、オス 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10週齢、計8時点

    各時点で6匹ずつ 測定時にマウスを殺すので、異なる時点は異なるマウス 同じ時点の異なる臓器は、同じ6匹のマウスのもの 13臓器 (BAT、大脳、eWAT、腸、心臓、視床下部と脳下垂体、 iWAT、腎臓、肝臓、肺、筋肉、膵臓、脾臓) 総サンプル数: 8 × 6 × 13 = 624 RNA-seqで測定 体重、血糖値も測定 12 / 162
  6. データが欲しい方へ データはGakuNin RDMに置いてあります (PJメンバーのみ)。 富山大学データ: https://rdm.nii.ac.jp/cg9mp/ RNA-seqデータ: https://rdm.nii.ac.jp/gcxbt/ 体重、血糖値データ: https://rdm.nii.ac.jp/rfzt3/

    DEG (時間変化) リスト: https://rdm.nii.ac.jp/fy52s/ DEG (時間変化) GO解析: https://rdm.nii.ac.jp/dg5ba/ DEG (臓器特異的) リスト: https://rdm.nii.ac.jp/tcyr3/ DEG (臓器特異的) GO解析: https://rdm.nii.ac.jp/wdm8n/ DNBのリスト: https://rdm.nii.ac.jp/efuw5/ DNBのGO解析: https://rdm.nii.ac.jp/st47x/ 13 / 162
  7. TPMを再計算 TPM (Transcripts per million, 正規化法の一つ) の内容 1. 各転写産物の発現量をその長さで割る。 2.

    各サンプルについて、総和で割り1Mを掛ける。 2番目は「比率」に変換する処理なので、極端に大きな値のもの がいた場合、他の値が全体的に小さくなる。 実際に、75%点の位置は、上位1%の占める割合 (前ページの図 の右下) と、真逆の動きをしていた。 総和を、刈り込み平均 × 遺伝子数に変更 刈り込み率として5%, 10%, 15%, 20%を試し、最もデータ がよく揃った10%を採用 32 / 162
  8. 転写産物の種類 さらに、使用する転写産物の種類を絞った。 Gbkey 個数 Gbkey 個数 mRNA 92486 tRNA 422

    ncRNA 28118 J_segment 94 misc_RNA 10559 rRNA 64 exon 5480 D_segment 24 precursor_RNA 1228 C_region 21 V_segment 527 33 / 162
  9. 転写産物の選択 exon, VDJ組み換え関係 (抗体とTCR), tRNA, rRNAは除くとし て、ncRNAで迷った。 併記されていたRefSeqのIDを確認したところ、ncRNA, misc_RNA, precursor_RNAはいずれもNRまたはXRから始まる

    非mRNAだった。何を基準に区別しているかは不明。 mRNAならNMまたはXM, それ以外はNRまたはXR これらの中にはmiRNAやsnoRNAなどの短いものも多く含まれ、 TPM正規化のステップ1において誤差増幅効果があると考え、 除外することにした。 結局、mRNAのみを使用した。 34 / 162
  10. 褐色脂肪組織の主な遺伝子とGO注釈 遺伝子記号 GO注釈 LOC115486519 lipid metabolic process Ucp1 multicellular organism

    development Cidea fatty acid metabolic process Gldn fatty acid biosynthetic process Tmem74bos intracellular signal transduction Atp4b brown fat cell differentiation Tcl1 positive regulation of MAPK cascade Defb30 77 / 162
  11. 大脳の主な遺伝子とGO注釈 遺伝子記号 GO注釈 Ascl5 signal transduction Smim43 multicellular organism development

    Psmb11 cell differentiation Cer1 nervous system development Clrn2 ion transport Tbx22 transmembrane transport Arr3 chemical synaptic transmission Padi6 intracellular signal transduction 78 / 162
  12. eWATの主な遺伝子とGO注釈 遺伝子記号 GO注釈 S100a7l2 spermatogenesis Prss46 inflammatory response Col6a5 positive

    regulation of gene expression Dppa3 cellular response to tumor necrosis factor Epyc spermatid development Pspn Serpinb12 H1f8 79 / 162
  13. eWAT+iWATの主な遺伝子とGO注釈 遺伝子記号 GO注釈 Gm5460 signal transduction Mageb18 cell adhesion Faiml

    cell differentiation Bpifb6 lipid metabolic process Il13 extracellular matrix organization Gsc inflammatory response Olfr733 proteolysis Olfr735 80 / 162
  14. 腸の主な遺伝子とGO注釈 遺伝子記号 GO注釈 Defa31 cell differentiation Defa35 innate immune response

    Defa30 lipid metabolic process Defa5 proteolysis Defa27 immune system process Defa24 ion transport Enpp7 apoptotic process Defa3 defense response to Gram-positive bacterium 81 / 162
  15. 心臓の主な遺伝子とGO注釈 遺伝子記号 GO注釈 Nppb heart development Mybpc3 cardiac muscle contraction

    Nppa negative regulation of transcription from RNA polymerase II promoter Pln cell differentiation Gm30302 ion transport Lrrc10 sarcomere organization Mov10l1 transmembrane transport Myh6 regulation of heart rate 82 / 162
  16. 視床下部等の主な遺伝子とGO注釈 遺伝子記号 GO注釈 Prl regulation of transcription from RNA polymerase

    II promoter Fshb regulation of transcription, DNA-templated Cga signal transduction Pou1f1 cell differentiation Gh multicellular organism development Npvf positive regulation of transcription from RNA polymerase II promoter Pou4f2 negative regulation of transcription from RNA polymerase II promoter 83 / 162
  17. 腎臓の主な遺伝子とGO注釈 遺伝子記号 GO注釈 Defb29 transmembrane transport Akr1c21 ion transport Cyp2j11

    multicellular organism development Slc34a1 lipid metabolic process Kap kidney development Bsnd positive regulation of transcription, DNA- templated Cldn16 Tmem52b 85 / 162
  18. 肝臓の主な遺伝子とGO注釈 遺伝子記号 GO注釈 Cyp2c54 lipid metabolic process Cyp2c50 steroid metabolic

    process Cyp2c37 xenobiotic metabolic process Sult2a8 cholesterol metabolic process Cfhr1 proteolysis Cyp1a2 immune system process Cyp2c29 innate immune response Cyp2c39 fatty acid metabolic process 86 / 162
  19. 肺の主な遺伝子とGO注釈 遺伝子記号 GO注釈 Scgb3a2 multicellular organism development Scgb1a1 cell differentiation

    Cxcl15 cell adhesion Sftpb positive regulation of cell proliferation Sftpc spermatogenesis Cxcl17 cell projection organization 4930562C15Rik cilium assembly S100z 87 / 162
  20. 筋肉の主な遺伝子とGO注釈 遺伝子記号 GO注釈 Tppp2 multicellular organism development Ppp1r27 regulation of

    transcription from RNA polymerase II promoter Atp1b4 regulation of transcription, DNA-templated Myf6 positive regulation of transcription from RNA polymerase II promoter Myh8 cell differentiation Actn3 ion transport Myoz3 positive regulation of transcription, DNA- templated 88 / 162
  21. 脾臓の主な遺伝子とGO注釈 遺伝子記号 GO注釈 Cldn13 cell cycle Oosp2 cell division H2ac1

    cellular response to DNA damage stimulus Ms4a3 immune system process Olfr67 DNA repair Hemgn negative regulation of transcription from RNA polymerase II promoter Tmem270 innate immune response Asb17 nucleosome assembly 90 / 162
  22. 臓器特異的遺伝子の解釈 全体的に、一般的な知見とよく合う結果が得られた。 BAT: UCP1、脂質代謝 脳: シナプス伝達、イオン輸送 腸: 抗菌ペプチド (Defensin)、自然免疫応答 視床下部と下垂体:

    各種ホルモン 腎臓: トランスポーター 肝臓: 代謝酵素 (Cytochrome P450) 肺: 線毛 筋肉: アクチンとミオシン 膵臓: 分解酵素 (アミラーゼ、トリプシンなど)、インスリン 脾臓: 細胞分裂、免疫応答 91 / 162
  23. 動的ネットワークバイオマーカー解析 二段階法 (Oku, TBIO, 2019) で遺伝子を選択 MAD比の閾値は2 相関係数の閾値は自動調節 実験群: 各臓器の各時点のデータ

    (サンプル数6) 対照群: 同じ臓器の他の時点のデータをプールしたもの (サン プル数42) 最小クラスタサイズ: 10 最大クラスタ数: 3 MAD: median absolute deviation, 中央絶対偏差。標準偏差より外れ値に強い。 95 / 162
  24. 先行研究で取れた遺伝子 (再掲) 先行研究 (Koizumi+, 2019) で 取れた147個の遺伝子について 調べた。 ewatの6週 の1つのサンプルで

    バースト的に高発現していた。 他の臓器はほぼ変化なし。batの 6週で少し高い程度。 123 / 162
  25. 成長関連遺伝子の除外 陳先生より、成長関連遺伝子を除外してはどうかと助言頂いたの で、試した。 Gene Ontology Consortium (http://geneontology.org/) よ り、最新のGOリストおよびマウスの注釈リストを取得した。 Biological

    Processの直下にある"developmental process"の 注釈を持つ遺伝子はたった21個だけだった。 その下流、および、同じくBP直下の"growth"の下流を取得し た。 しかし、名前に"development"や"growth"が付いているにも関 わらず、選ばれていないものが半分近くいた。 GOの階層性の情報 (is_a属性) は不完全かもしれない。 135 / 162
  26. 成長関連遺伝子の除外、続き 仕方がないので、自分自身または上流に"development"また は"growth"を含む注釈を取得した。 確認すると、"transforming growth factor" など固有名詞の一部 も含まれていたので、"growth factor"と"growth plate"はエス

    ケープした。 27941個のGO BPのうち、成長関係は5306個となった。 解析対象の遺伝子数は20828から14536 (約70%) になった。 意外にも、主成分分析、ヒートマップ、発現変動遺伝子、エンリ ッチメント解析の結果が ほとんど変わらなかった。 発現変動遺伝子に関しては、個数が約60%に減った。 136 / 162
  27. 大きな変化の起きた順 各臓器において、大きな変化が起きた時点を調べ、その前後関係 からネットワークを作るというアイデア 最初に犬嶌先生が実施、本資料には奥が実施したそれとは異なる 2つのやり方の結果を掲載 まず、各臓器において、DEGを、時間と共に増加するもの (up 群) と減少するもの (dn群)

    に分けた。 次に、各遺伝子をZスコア化し、各群で平均化 → 26×8 の行列 続いて、以下のいずれかを実施 方法1. ガウス過程回帰をかけ、微分し、ピークの位置を推定 方法2. up群のみを用い、自己共分散を計算 151 / 162
  28. ピーク位置のまとめ 3wから5wにかけて、多くの臓器で変化が起こる。 一旦落ち着く。 5wから6wにかけて、再び変化が起こる。 up群: eWAT, iWAT, 膵臓 dn群: eWAT,

    膵臓、心臓 7wから8wにかけて、BATが急激に変化する。 8wから10wにかけて、BATが逆方向に変化する。 153 / 162